蛋白酶K(德国Merck 公司) ,Trizol (美国Invitro-gen 公司) ,一步法RT-PCR 试剂盒(美国Qiagen 公司) ,Taq 酶(美国Promega 公司) 。内对照选用β-肌动蛋白(β2actin) 。所用引物均由上海生物工程公司合成。

　　 1.3 方法
　　 1.3.1 组织学观察及免疫组化染色　常规HE制片,免疫组化采用EnVision 二步法,DAB 显色,所有抗体及EnVision试剂盒均购自Dako公司。选用LCA、MyoD1、Myogenin、CD99、Desmin、CK、Vimentin、S-100 对所有病例标本进行免疫分型及鉴别诊断,由两位以上病理学专家阅片。
　　 1.3.2 石蜡包埋组织总RNA 抽提方法　见文献。
　　 1.3.3 RT-PCR 本组所有病例融合基因的检测均采用一步法RT-PCR 技术,首先对模板mRNA质量用β-actin 进行检测; 然后分别进PAX3-FKHR、EWS-FLI1 和TLS-CHOP 融合基因的检测,在一步法RT-PCR 的基础上,将RT-PCR 产物作为模板进行半巢式或巢式扩增。引物对退火温度及扩增片段长度见表2。1) RT-PCR 体系:25μL ,其中含5 ×缓冲液5. 0μL ;10mmol/ LdNTP ;上下游引物(终浓度为25pmol/μL) 0. 6μL ;RT-PCR 混合酶(德国Qiangen 公司) 1μL ;RNA 酶抑制剂4U (40U/μL) ; 总RNA2uL (0. 5μg/μL) 。2) 巢式PCR:为增加敏感性和特异性进行巢式或半巢式扩增。体系如下: 10 ×buffer4. 5μL , dNTP (10mmol/ L)0. 45μL ,MgCl2 (25mmol/ L) 2. 5μL ,分别加对应的半巢或巢式引物见表2 ,终浓度为25pmol/μL ; Taq 酶(美国Promega 公司) 1U(5U/μL) ,第一轮RT2PCR 产物1μL ,补无核酶水使反应体系至25μL 。PCR 条件: 95 ℃4min ;94 ℃30s ,退火温度见表2 ,45s ,72 ℃60s ,35 个循环;72 ℃10min 终末延伸。每一轮扩增以已知阳性样本作为阳性对照,以无核酶水代替总RNA 作为替代对照,并设立阴性对照。3) 测序:PCR 产物由上海基康生物技术公司纯化并测序。

　　 2 结果
　　 2.1 　组织形态学及免疫组化染色
　　 C1 镜下:肿瘤位于肌肉组织内,被纤维组织分割成片状,细胞排列紧密,实体状,瘤细胞体积小,胞浆少、嗜酸性,部分围绕间质排列,形成腺泡状的形态结构,部分区有假菊形团结构(图1) ,纤维化性的小圆细胞肿瘤像神经源性肿瘤,免疫组化染色显示CD99 阳性,MyoD1 和Myogenin 阳性, 提示为ES/PNET或者RMS。C2 镜下:肿瘤细胞为小圆形,被纤维组织分割成片状,胞浆少,染色质深染、粉尘状,弥漫分布(图2) 。免疫组化染色显示CD99 ,结蛋白(Desmin) 均阳性,MyoD1 阴性,倾向于PNET。C3 镜下:瘤细胞为圆形或短梭形的小细胞,胞浆少,较疏松,粘液背景,血管丰富,分枝状(图3) 。免疫组化染色显示Myogenin 阳性、vimentin 阳性、S - 100 + /- 、NSE + / - ,PAS 染色阳性,CD99、MyoD1 阴性,初步考虑MLS 或RMS。

　　 2.2 RT-PCR结果所有肉瘤组织抽提的总RNA均做肌动蛋白mRNA扩增,以确定mRNA的质量可靠,3 例均检测出融合基因表达,C1 检测出为PAX32FKHR 融合基因表达符合ARMS 的染色体易位特点(图4) ,C2 检测出EWS2FLI1 融合基因表达符合ES/ PNET 的染色体易位特点(图4) ,C3 检测出TLS2CHOP 融合基因表达符合MLS 的染色体易位特点(图5) 。