血管生成不同于血管发生,是指从已经存在的血管生长出新的分枝血管的过程。血管生成在人体发育、组织修复等正常生理过程中发挥重要作用,同时也是肿瘤、慢性炎症等血管增生性疾病的重要病理特征。启动血管生成过程需要上调促血管生成因子的表达,但同时也需要下调血管生成抑制分子的表达,因此,某一组织在某一特定时间是否能够进行血管生成取决于本地环境中血管生成因子和血管生成抑制因子之间的平衡。血管生成抑制素是第一个从长有肿瘤动物的血清和尿液中分离得到的内源性血管生成抑制因子,以后通过相似的方法又分离得到了血管内皮抑制素、TSP-1和serine antithrombin。现以血管生成抑制素为代表,介绍近年来关于其分子作用机理的研究进展以及其作为抗肿瘤药物的应用前景。

　　1　血管生成抑制素的产生和结构特点
　　血管生成抑制素是纤溶酶原在体内的天然水解产物,分子量38kD。1994年,哈佛医学院的Folkman实验室首次从肺癌转移模型小鼠的血清和尿液中分离得到,由于它能够有效抑制内皮细胞的增殖、迁移和管状结构的形成,因此将其命名为血管生成抑制素。血管生成抑制素是纤溶酶原在体内的天然水解片断,含有纤溶酶原的前4个圆饼状结构( 90 ～470氨基酸) ,有两处糖基化位点。每个圆饼状结构都由最多80个氨基酸以高度保守的方式排列而成,并在内部形成3个二硫键维持结构的稳定性。各圆饼状结构在氨基酸序列上具有很大的相似性(大约50%) ,它们抑制内皮细胞生长的能力依次为K1、K3、K2、K4。事实上, K4几乎不具备抑制内皮细胞生长的能力,而血管生成抑制素( K1-3)比血管生成抑制素( K1-4 ) 具有更强的抑制内皮细胞生长的能力。除了这4个圆饼状结构外,在纤溶酶原中还有一个圆饼状结构K5, K5同样也含有80个氨基酸残基,并且在序列上比K1 具有更高的相似性(大约60%) 。体外实验表明, K5抑制血管内皮细胞增殖能力是血管生成抑制素( K124)的几倍,由于二者在抑制血管内皮细胞增殖方面具有协同效应,因此它们可能通过不同的途径发挥作用。然而体外实验结果并不一定代表在体效果,因为K5在体内的半衰期相当短。此外,尿激酶激活型纤溶酶原作用于人纤溶酶原,除了产生血管生成抑制素( K1-4)外,也会产生K1-5。K1-5在抑制血管内皮细胞增殖的能力方面是血管生成抑制素的50倍,由于K1-5在体内也同样存在,因此K1-5在调节病理性血管生成过程中可能也发挥一定的作用。

　　由于纤溶酶原存在不同的裂解位点,因此在不同的细胞环境中会产生不同形式的血管生成抑制素。以下是血管生成抑制素的产生过程:首先,纤溶酶原在激活因子的作用下产生纤溶酶,而磷酸甘油酯激酶的激活会抑制纤溶酶的产生,此时环境中的纤溶酶或其他氨基酸蛋白酶作用于纤溶酶原或纤溶酶自身首先生成血管生成抑制素(K1-4、5) , 然后在周围多种金属蛋白酶的作用下进一步生成K1-3或K1-4。存在于基质中的多种蛋白水解酶及肿瘤细胞产生的水解酶都能作用于纤溶酶或纤溶酶原产生功能性血管生成抑制素样片段。K5的生成稍有不同,中性粒细胞弹性蛋白酶作用于纤溶酶原会产生血管生成抑制素(K1-3) ,游离的K4和纤溶酶原片段,该片段含有K5和丝氨酸蛋白酶区,然后,在金属蛋白酶的作用下,进一步产生游离的K5。总之,纤溶酶原裂解位点的复杂性以及翻译后修饰过程使得血管生成抑制素的产生和调节过程更为复杂,并且极其依赖周围环境。

　　2　血管生成抑制素的作用原理
　　血管生成抑制素是在细胞膜上还是进入细胞内来完成其对内皮细胞的抑制作用,尚未见报道。无论是纤溶酶原还是纤溶酶在细胞膜表面都存在多种受体,然而它们并没有抑制血管生成功能,这说明血管生成抑制素可能通过不同的细胞表面受体发挥作用。此外,如前所述,不同的裂解方式会产生不同的血管生成抑制素,以及不同的翻译后修饰过程都会导致血管生成抑制素以不同的方式结合并将信号传递到细胞内。除了细胞表面受体外,血管生成抑制素也能结合细胞外的某些分子如组织型纤溶酶原抑制因子,说明血管生成抑制素也可以通过调节细胞周围的蛋白水解酶活性参与血管生成过程。

　　2.1　细胞表面受体整合素α vβ 3
　　血管生成抑制素是在细胞膜上还是进入细胞内来完成其对内皮细胞的抑制作用,尚未见报道,然而,不论是哪种作用机制,都涉及到内皮细胞中特异性受体的参与。Tarui等研究发现,在牛主动脉内皮细胞,血管生成抑制素n能够与整合素细胞α vβ 3结合,然而这种结合并不会形成张力纤维,并且应用赖氨酸的拮抗剂能够阻止BAE细胞向血管生成抑制素的黏附,表明血管生成抑制素中Kringle赖氨酸位点的暴露对于整合素的结合是必要的。一般情况下,灭活FAK基因或用反义寡核苷酸干扰FAK的作用均可导致细胞迁移受阻和细胞凋亡增加。Claesson 等研究发现血管生成抑制素能够激活FAK,从而引起细胞迁移的下降和凋亡的增加。进一步研究表明,这种作用与RGD结构无关,不涉及到Src的共活化,因此,血管生成抑制素对FAK的激活并不依赖整合素的参与。然而,在人绒癌细胞JEG - 3中,血管生成抑制素却能通过α vβ 3 /FAK信号通路下调MMP的表达,可见,在不同的细胞类型中血管生成抑制素可能通过不同的机制参与对细胞功能的调节。

　　2.2　内皮细胞表面的F1 F0ATP合成酶
　　F1 F0ATP合成酶存在于内皮细胞表面,在其结构中含有两个部分: F0 部分位于膜内,充当质子循环泵的功能, F1 部分执行ADP←→ATP催化功能。血管生成抑制素能够结合内皮细胞表面的F1 F0ATP合成酶,并且同该酶的一种抑制分子IF1 ( inhibitor of F1)具有竞争作用。进一步研究表明,血管生成抑制素与F1 F0ATP合成酶结合后对于内皮细胞的抑制作用是pH依赖的,因为在体外实验中,在pH715 和pH615时,血管生成抑制素都能结合并抑制F1 F0ATP合成酶的活性,而只有在pH615时,内皮细胞才能被血管生成抑制素杀死。在肿瘤快速生长的过程中,肿瘤细胞的代谢产物由于异常的血管生成过程而无法通过血液循环及时清除,因此,常导致肿瘤组织内环境pH降低。血管生成抑制素与内皮细胞表面的F1 F0ATP
合成酶结合后对于内皮细胞作用的pH依赖性,提示F1 F0ATP合成酶可能作为一种新的治疗肿瘤的靶向分子而发挥作用。

　　2.3　血管生成抑制素- 结合蛋白( ang iomotin) 最近,通过酵母双杂交实验又发现了一种新的血管生成抑制素- 结合蛋白( angiomotin) ,进一步研究表明, angiomotin属于一个新的蛋白质家族,该家族成员都具有保守的coiled2coil和PDZ结合区域。在血管内皮细胞中表达外源性人angiomotin能够将建成的管状结构维持30天,并且能够促进从这些管状结构产生的内皮细胞的迁移能力。血管生成抑制素只有作用于转染angiomotin的细胞系才能增加FAK的活性并且抑制细胞迁移和管状结构的形成。现在还没有证据表明血管生成抑制素对于angiomotin表达的影响是直接的还是间接的。Angiomotin只参与血管生成抑制素对于细胞迁移和形态的调节,对于内皮细胞增殖和死亡方面的调节并没有作用。

　　2.4　其他
　　有实验发现血管生成抑制素- 结合蛋白Annex-in,不仅能同血管生成抑制素结合,同时也是纤溶酶原的受体之一。进一步研究表明,血管生成抑制素与Annexin结合后,能够引起细胞内游离钙离子浓度的增加从而抑制血管内皮细胞的增殖并诱导细胞凋亡。然而,纤溶酶原并不具备血管生成抑制素样功能,但二者为何能够结合相同的受体并引起不同的细胞反应有待于进一步研究。

　　最近,又发现了一种新的血管生成抑制素结合蛋白,由于该蛋白是一种新的蛋白,因此将其命名为血管生成抑制素结合序列蛋白( angiostatin binding se-quence p rotein,ABSP) ,这种蛋白在血管生成抑制素n生物学效应中究竟发挥什么样的作用还有待于进一步研究。

　　另外,在细胞表面还存在另一种硫酸软骨素蛋白质多糖NG2,它与血管生成抑制素结合后,并不直接介导血管生成抑制素的信号通路,但却可以通过调节细胞外血管生成抑制素的活性促进中枢系统中血管生成依赖性肿瘤的生长。

　　3 血管生成抑制素在肿瘤治疗中的应用
　　早在1971年Folkman提出可以通过抑制肿瘤的血管生成达到治疗肿瘤的目的。Folkman的观点认为肿瘤的生长依赖于新生血管的生成,当肿瘤的体积达到2～3 mm3以上时就必须依赖血管为其继续增殖提供必需的氧气和营养物质。如果抑制肿瘤的血管生成,就会切断肿瘤的营养供给,导致肿瘤的退化、萎缩。这一观点已为大量的研究结果所证实。肿瘤细胞的遗传学不稳定性为直接针对肿瘤细胞的治疗带来困难,然而肿瘤的生长和转移过程离不开血管生成,因此选择某些血管生成抑制因子以遗传学相对稳定的血管内皮细胞为靶向,为肿瘤的治疗提供了一条新途径。与传统的以肿瘤细胞为靶点的治疗方法相比,抗血管生成疗法具有低毒、广谱、特异性高及不易产生抗药性的优点。血管生成抑制素已经进入了Ⅰ期临床试验阶段,未显示出剂量限制性毒性。

　　临床试验血管生成抑制素联合抗肿瘤治疗包括:
　　(1)联合应用两种不同作用机制的血管生成抑制因子,从不同途径阻断血管生成,取得较单独使用一种因子更好的效果。Ponnazhagan等采用携带内皮细胞抑制素/血管生成抑制素基因AAV载体治疗荷瘤小鼠。结果发现同时携带两种基因的重组AAV可以完全抑制肿瘤的生长。
　　(2)血管生成抑制素与放疗联合应用,增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。Mauceri等采用血管生成抑制素与放疗联合治疗移植了Lewis肺癌肿瘤的小鼠与移植了人恶性胶质瘤、鳞状细胞癌、前列腺癌的无胸腺裸鼠,发现联合治疗可显著抑制肿瘤的生长。
　　(3)与化疗联合可以增强肿瘤细胞对化疗的敏感性。Galaup等用含有血管生成抑制素基因的重组腺病毒联合紫杉萜治疗移植了人前列腺癌的小鼠,发现联合用药的小鼠肿瘤出现消退,而单一用药组的小鼠肿瘤未出现消退。

　　4 问题与展望
　　血管生成抑制素作为治疗药物存在半衰期短、用药剂量高、提纯蛋白的花费较为昂贵、不易运输和贮存等缺点,又为血管生成抑制素的广泛应用带来了困难。解决方法之一是构建血管生成抑制素表达载体进行基因治疗。抗血管生成基因治疗可以介导血管生成抑制因子在体内长期表达,不需要短期内重复给药,也不需纯化蛋白,在操作上相对简单,成本也较低。但基因治疗仍存在着表达不稳定、转染效率低、病毒载体具有潜在危险性等目前难以解决的问题。另一种方法是在细胞表面寻找能够同血管生成抑制素结合并介导其血管抑制功能的特异性受体,从而研制出一种更为稳定的血管生成抑制素类似物。

　　但是,到目前为止,由于存在不同的血管生成抑制素片段及糖异构体,并且在细胞表面鉴定出的多种受体又分别介导血管生成抑制素的不同功能,都为这方面的研究带来了困难。相信随着血管生成抑制素作用机制研究的不断深入,必将出现更适合于肿瘤治疗的血管生成抑制因子类药物。