（南京市口腔医院口腔颌面外科 施佩花综述）
RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是由双链RNA诱导，在细胞内有效地抑制具有互补序列的内源性基因的现象。RNAi普遍存在于生物体中，参与细胞正常生长和发育的调控、稳定转座子，同时调控机体抵御外来病毒感染。本文就RNAi在口腔肿瘤治疗中的应用作一综述。
1 RNA干扰的研究历史及现状
RNAi最早是在线虫体内被发现的。学者们用反义链RNA阻断par-1基因的表达，同时注入正义链RNA作对照，结果两者同样阻断该基因的表达。一些学者用正义链RNA和反义链RNA的混合物注入线虫，结果出现了比单独注射正义链RNA或反义链RNA都要强的基因抑制，即RNAi现象。
目前，RNAi在许多生物中被发现，如植物、真菌等。在哺乳动物中也存在RNAi现象。因此学者们推断RNAi是生物体内广泛存在的基因调控机制。近年来，利用合成的siRNA（sm all interferingRNA）抑制特定基因表达，探讨基因功能，探索口腔肿瘤治疗新途径。
2 RNA干扰的特点和作用机制
2.1 RNA干扰的特点
RNAi的特点有
1）高稳定性：siRNA具有3′端悬垂的碱基可抵御核糖核酸酶的破坏作用；
2）高特异性：RNAi具有严格的序列特异性；
3）高效性：RNAi作用只在基因转录后细胞质中发挥作用，极少量的siRNA分子就能抑制相应基因的表达。
2.2 RNA干扰的作用机制
RNAi的作用机制可能为正义链RNA和反义链RNA的混合物引入后，它们被D ICER 酶切割为21～23个核苷酸长度的siRNA，每个siRNA均带有3′端单链尾巴和磷酸化的5′端。siRNA与RNA酶形成无活性的RNA诱导沉默复合物（RNAinduced silencingcom plex，R ISC），当siRNA双链解开，R ISC则被激活，活化的R ISC 识别和降解靶m RNA。
3 RNA 干扰在口腔肿瘤基因治疗中的应用
3.1 抑制癌基因的表达
癌基因的激活被认为是肿瘤发生的根本原因之一。ras癌基因有3 个相似的家族成员，即H -ras、K -ras 和N -ras。在我国，恶性黑色素瘤发生于口腔黏膜的约占80% 。在黑色素瘤细胞内可检测到N -ras基因的突变。因此有学者构建了siRNA 靶向干扰N -ras 基因，结果显示抑制N -ras 的表达可诱导人黑色素瘤细胞的凋亡。大量研究证实，S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein2，Skp2）基因是潜在的癌基因，其表达产物Skp2 蛋白是泛素化的必要条件，它还参与P27 蛋白的降解。在多种癌细胞包括口腔鳞状细胞癌细胞中可观察到由于P27 蛋白过度降解而导致其低表达，但Skp2 蛋白过度表达。学者们构建了Skp2 基因、特异性siR N A 表达质粒，转染了口腔鳞状细胞癌细胞，发现转染siR N A 表达质粒的细胞中Skp2蛋白表达减少而P27 蛋白表达增加，且P27 蛋白比对照细胞中的更稳定；Skp2 基因的siR N A 在体内外均抑制了癌细胞的增殖，因此Skp2 基因可以成为口腔鳞状细胞癌基因治疗的靶点。
3.2 上调抑癌基因的表达
抑癌基因的低表达是癌发生的另一重要原因。p27 基因是重要的抑癌基因之一，其产物是细胞周期负性调控因子。细胞由静止状态进入增殖状态需要P27 蛋白的泛素化水解，从而解除对细胞周期素-细胞依赖性激酶的抑制作用，使细胞顺利通过细胞周期G 1 期到S 期转变的检测点，细胞周期得以进行。在很多类型的恶性肿瘤中，都可以观察到p27 基因表达下调。CK sl基因的表达上调与p27 基因的下调密切相关，且与肿瘤患者预后较差有关。有学者用CK sl基因特异siRNA 对口腔鳞状细胞癌细胞进行干扰，成功抑制了CK sl基因的表达并诱导了p27 基因在细胞中的积累，结果抑制了口腔鳞状细胞癌细胞的生长。还有学者将CK s1基因和Skp2 基因的siRNA 质粒转染口腔肿瘤细胞，即可抑制肿瘤细胞的增殖，同时使肿瘤细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的。因此，通过对CK sl基因的抑制可以调节p27 基因产物，从而控制细胞增殖，为治疗口腔鳞状细胞癌提供了新途径。
3.3 下调凋亡抑制基因的表达
研究表明，细胞凋亡过程的异常对众多恶性肿瘤的发生具有重要作用。survivin 是仅在肿瘤细胞中表达的凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis，IAP），在肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用。研究表明，抑制survivin 基因的表达可介导肿瘤细胞的凋亡，进而抑制肿瘤的生长。有学者发现survivin 在口腔鳞状细胞癌中过量表达，因此他们用特异性siRNA 干扰口腔鳞状细胞癌中的角质基底细胞癌（keratode basalom a，KB）细胞株中survivin 的表达，结果显示细胞内的survivin表达持续下降，KB 细胞的增殖下降了34.2% ，由长春新碱诱导的细胞凋亡率上升了29.8% ，而且提高了肿瘤细胞对放射线的敏感性。
3.4 抑制多重耐药基因的表达
多重耐药（m ulti-drug resistance，MDR）是肿瘤细胞对多种结构不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗肿瘤药物的抵抗作用。研究表明，肿瘤的耐药性主要与MDR -1 基因有关，针对该基因的RNAi可以使MDR -1 基因的水平下调而进一步提高细胞内的药物浓度，提高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。有学者在口腔癌细胞株中，应用siRNA 成功抑制了MDR -1 基因的表达，减少了跨膜糖蛋白P-gp/P-170 的产生，从而使抗药表型逆转，并恢复了细胞对药物的敏感性。这些研究结果表明，siRNA 可尝试用于提高口腔肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性来达到治疗的目的。
3.5 抑制与口腔肿瘤相关病毒基因的表达
B urkitt淋巴瘤好发于颜面和腭部。研究显示，恶性淋巴瘤的发生与爱波司坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）相关。在与EBV 有关的肿瘤中都可以检测到EBV 潜伏蛋白和爱波司坦- 巴尔病毒核抗原（Epstein-Barr virus nuclear antigen，EBNA），它们对潜伏的游离EBV 的复制和维持至关重要。有学者在R aji细胞株应用siRNA 成功干扰了EBNA 1 基因的表达，导致EBNA 1 mRNA 缺乏和抑制Raji细胞增殖，而且抑制EBNA 1 可以下调癌基因EBNA 2，增加细胞周期中G0/G 1 的比例。
3.6 抑制与信号转导途径相关突变基因的表达
BRAF 蛋白位于有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶途径的入口处，调节细胞的生长和发育。BRAF 基因在恶性黑色素瘤中的突变受到研究者的关注。在我国恶性黑色素瘤发生于口腔黏膜的比发生于皮肤的多，占80% 以上，因此对恶性黑色素瘤基因治疗的研究有助于弥补现有治疗手段的不足。有学者对BRAF 基因突变的恶性黑色素瘤细胞株用特异性的siRNA 进行干扰，结果显示RNAi后的细胞体外增殖及侵袭能力下降。这为恶性黑色素瘤基因治疗的临床应用开辟了新的思路。
3.7 抑制与口腔肿瘤侵袭相关基因的表达
肿瘤的侵袭程度越高则患者的预后越差。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2在口腔鳞状细胞癌和星状细胞癌的表达明显增强，与肿瘤的侵袭程度呈正相关。研究证实，在成釉细胞瘤中MMP-2﹑MMP-9有较强的表达，能降解细胞外基质，促进肿瘤侵袭转移。因此有学者构建了MMP-2特异性siRNA 转染原代培养的成釉细胞瘤细胞，发现转染后的瘤细胞MMP-2 mRNA水平显著降低，酶原性MMP-2和活性MMP-2显著减少。
3.8 其他
层粘连蛋白（lam inin，LN）是细胞外基质构成基底膜的重要组成部分，在胚胎的生长发育、细胞增殖、分化、迁移、黏附、神经生长以及肿瘤发生与转移等多方面发挥重要作用。研究发现，LN -5 在多种恶性肿瘤包括口腔鳞状细胞癌中表达。有学者构建了特异性siRNA 干扰非侵袭性的口腔鳞状细胞癌株的LN -5γ2 的表达，发现该癌细胞的LN -5 表达下降，导致癌细胞间的黏附力下降，在体外的迁徙及侵袭能力下降，且在体内的成瘤作用降低。因此，LN -5 在口腔鳞状细胞癌中有抑制癌细胞侵袭转移的作用。但有研究发现，在某些侵袭性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌等中缺乏LN -5 的表达。因此，目前有关LN 在肿瘤发生及侵袭转移中的生物学作用尚不明确，存在争议。
4 结束语
RNAi技术可用于抑制癌基因表达，恢复正常基因的功能，增加肿瘤细胞对现有治疗手段的敏感性，还能筛选基因治疗作用靶点，是研究肿瘤发生发展及治疗的有效手段。目前，RNAi用于口腔肿瘤的治疗仅局限在细胞研究阶段，同时RNAi对实体瘤的治疗还存在许多问题如：肿瘤细胞是否会对RNAi介导的序列特异性mRNA 降解产生抵抗性，在人体内RNAi是否与体外及动物模型有相似的研究结果，能否找到并构建无毒或者人体可耐受的RNAi载体等。目前转染的方法虽能将siRNA 导入细胞，但效率不是很高。因此，还需研发更为有效的RNAi技术，同时寻找最佳RNAi作用靶点，以增强RNAi的作用。随着对RNAi的进一步认识和RNAi技术的不断改进，RNAi技术将被更广泛地应用，使口腔肿瘤的基因治疗能够早日实现。
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